細(xì)胞培養(yǎng)（Cell Culture）專(zhuān)題：

1、pcDNA3.1＋-gD的線性化: pcDNA3.1＋使用說(shuō)明書(shū)推薦了以下幾個(gè)酶作為線性化酶(BglⅡ MfeⅡ Bst1107Ⅰ Eam1105Ⅰ PvuⅠ ScaⅠ SspⅠ),通過(guò)DNAMAN分析gD序列發(fā)現(xiàn)其帶有MfeⅡ酶切位點(diǎn)。

2、轉(zhuǎn)染前一天,在60mm的dish中接種8×105個(gè)細(xì)胞,加入5ml培養(yǎng)基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培養(yǎng),至轉(zhuǎn)染時(shí)要求細(xì)胞40%-80%匯合。

3、通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定pcDNA3.1＋-gD的濃度,用不含血清、抗生素、蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基稀釋2.5ug的pcDNA3.1＋-gD至總體積150ul，其zui小濃度不低于0.1ug/ul,稀釋后應(yīng)顛倒幾次EP管以混勻混合物。

4、向混勻的混合物中加入15ul轉(zhuǎn)染試劑(PolyFect Transfection Reagent Qiagen),用加樣器吹打5次。

6、在室溫下(20-25℃)孵育混合物5-10分鐘。

7、在孵育的同時(shí)，吸出dish中的培養(yǎng)基，用PBS液洗滌一次，加入3ml的培養(yǎng)基(含血清，不含抗生素)。

8、孵育完成后加入1ml培養(yǎng)基(含血清),用加樣器吹打2次，將產(chǎn)物全部加入60mm的dish中，輕輕搖動(dòng)dish以混勻。

9、37℃,5%CO2培養(yǎng)，在細(xì)胞匯合度不超過(guò)50%時(shí)加入G418進(jìn)行篩選。

轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染兩組細(xì)胞，組一在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞匯合度不超過(guò)50%時(shí)（一般是24小時(shí)）加入G418進(jìn)行篩選；組二在轉(zhuǎn)染后待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)1/4000、1/1000、1/300分別接種于dish中，48小時(shí)后加G418篩選。

10、加入G418后，每3天更換一次含有篩選濃度的G418。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡（5-7天）時(shí)，可以把G418的濃度減半維持篩選（此時(shí)可以加入適應(yīng)性培養(yǎng)基1：4來(lái)改善細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的同化作用）。

11、篩選10-14天后，可見(jiàn)有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后，制備細(xì)胞懸液，記數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入48孔板中增殖（為了減少實(shí)驗(yàn)失誤帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)建議凍存部分增殖細(xì)胞）。

12、細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總DNA，做PCR檢測(cè)目的基因是否存在。

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